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本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合lyticEnzyme特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除细胞壁后，然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

• RNaseA保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。
  
• 第一次使用时，可将试剂盒所带全部的RNaseA加入溶液YP1后置于4℃可保存3个月左右。如果溶液YP1中RNaseA时间较久失活了，提取的质粒可能有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNaseA即可。
  
• 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出，出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟即可恢复澄清，重新混匀，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
  
• Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，-20℃保存。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

• 所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12000rpm的台式离心机。
  
• 通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计都很难检测到。
  提取的质粒如果用于下游试验时通常建议使用量为：1～5μL用做PCR模板；5～10μL用于转化大肠杆菌，选择商业化的高效率的感受态细胞。
  
• 用户需要自备Sorbitol buffer(1M山梨醇，0.1M Na2EDTA，28mM β-巯基乙醇)。
  
  • 配制方法：在600mL去离子水里面溶解182.2g山梨醇，加入200mL 0.5M Na2EDTA(pH8.0)，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。
• 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候，酿酒酵母细胞是1～2×10⁷cells/mL，由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大，以上仅供参考。
  
• 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl，1 mMEDTA，pH8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

• 第一次使用前请先在漂洗液WB瓶和去蛋白液PE瓶中按标签指示加入无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
  
• 将RNaseA全部加入溶液P1中，混匀。每次使用后置于2～8℃保存。
  
• 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2% β-巯基乙醇，回复到室温备用。

• 柱平衡：向吸附柱EC中加入100μL平衡液，12000rpm离心1min，弃滤液，备用。
  
  • 平衡液可以增强硅胶膜的吸附核酸能力，请使用当天处理的吸附柱。
• 取1.5～5mL过夜培养的酵母培养物(不超过1～2×10⁷cells/ml)加入1.5mL离心管，12000rpm离心30sec，尽可能的倒干上清，收集菌体。
  
  • 如使用收集超过1.5mL菌液，可以离心弃上清后，在同一个1.5mL管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
• 加入300μL Sorbitol buffer，轻柔吹打充分重悬细胞；再加入50μL Lytic Enzyme储液，充分颠倒混匀，37℃温育1～3小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。
  
  • 如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大lyticEnzyme用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打，反复冻融等。
    
  • 玻璃珠法：向菌体中加入250μL溶液YP1(请先检查是否已加入RNaseA)重悬沉淀，彻底悬浮菌体，加入0.1g直径为0.45～0.55mm的酸洗玻璃珠，涡旋振荡10min，静置几分钟让玻璃珠沉淀，小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4。
• 12000rpm离心1min，尽可能吸弃上清。加250μL溶液YP1重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
  
  • 如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
• 加250μL的溶液YP2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解，室温放置4～5min。
  
  • 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5min！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠。如果很浑浊，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
• 加350μL溶液YP3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀此时会出现白
  色絮状沉淀。12000rpm离心10min，小心吸取上清加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中），避免吸取到漂浮的白色沉淀。
  
  • 加入溶液P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。
• 12000rpm离心1min，弃滤液。
  
• 加入500μL去蛋白液PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30sec，弃滤液。
  
• 加入600μL漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12000rpm离心30sec，弃滤液。再加入600μL漂洗液WB重复漂洗一次，弃滤液。
  
• 将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL～100μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在80℃～90℃水浴中预热可提高产量），室温放置2min，12000rpm离心1min，弃吸附柱。
  
  • 推荐：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置1min，12000rpm离心1min。洗脱两遍可提高浓度约10%。
    
  • 洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是需注意体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量（最小不应少于30μL）。